數(shù)字PCR (digital PCR, dPCR)是在普通PCR和定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的第三代PCR技術(shù)，通過有限稀釋和泊松分布統(tǒng)計(jì)實(shí)現(xiàn)**的**定量檢測。相比于前兩代PCR技術(shù)，dPCR能夠?qū)崿F(xiàn)DNA模板的**定量且對PCR抑制劑具有更強(qiáng)的耐受性。目前，該技術(shù)在致病菌和病毒、基因突變、甲基化DNA、轉(zhuǎn)基因成分和食品摻假的檢測中都得到了廣泛的應(yīng)用。

PCR技術(shù)的發(fā)展

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，尤其是基于PCR衍生出的一系列技術(shù)，因其具有操作簡單、快速準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)且靈敏度高的特點(diǎn)，己被廣泛應(yīng)用于各種檢測領(lǐng)域。1983年，美國KB Mullis教授發(fā)明了PCR技術(shù)用于核酸檢測，其被稱為**代PCR。隨后PCR技術(shù)出現(xiàn)井噴式發(fā)展，1992年科學(xué)家們在**代PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上引入熒光化學(xué)物質(zhì)，發(fā)明了定量PCR技術(shù)(quantitative PCR, qPCR)：通過熒光信號的變化對整個PCR過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，*后通過循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)和標(biāo)準(zhǔn)曲線對待測樣本進(jìn)行定量檢測。數(shù)字PCR (digital PCR, dPCR)技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用于檢測的第三代PCR技術(shù)。區(qū)別于qPCR依賴校準(zhǔn)曲線對靶基因定量的策略，該技術(shù)通過將PCR體系分散成無數(shù)個小體積的反應(yīng)單元進(jìn)行擴(kuò)增，允許單拷貝DNA的檢測，可以實(shí)現(xiàn)對核酸的**定量。每個小反應(yīng)單元含有少量或者沒有目標(biāo)序列，這有助于降低樣本中的多種抑制劑的干擾和PCR體系中模板之間的競爭效應(yīng)。表1總結(jié)了三代PCR技術(shù)的特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。

數(shù)字PCR的原理

dPCR的原理是通過有限稀釋將含有目的DNA的PCR反應(yīng)體系分散成無數(shù)個單一模板的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，再通過統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果及泊松分布校正實(shí)現(xiàn)目的DNA的**定量(圖1)。

    dPCR包括三個步驟：分散體系、PCR擴(kuò)增和信號檢測。通過樣品的稀釋和分散形成分散體系，這一步是限制dPCR發(fā)展應(yīng)用的一個重要因素，其所引起的分散數(shù)量和分散體積的不同極大地影響著定量結(jié)果的精度與準(zhǔn)確性。分散體系的形成增加了靶分子的有效濃度，并在一定程度上對存在干擾的復(fù)雜化合物進(jìn)行了純化，提高了靶分子和背景之間的比率％?；赿PCR統(tǒng)計(jì)的定量方式，反應(yīng)體系的分散數(shù)量越多，低濃度靶分子的檢測可能性就越大，檢測靈敏度就越高，同時多個單一的反應(yīng)單元也為多目標(biāo)序列的高通量檢測的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。此外，分散體積的不同會對拷貝數(shù)結(jié)果的測量產(chǎn)生影響，是造成dPCR精度下降的一個潛在因素，且與檢測限的大小形成反比關(guān)系。

    目前己成功應(yīng)用于商業(yè)化的dPCR系統(tǒng)根據(jù)分散方式的不同可分為三種主要類型：基于油包水微滴生成技術(shù)的微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、基于微孔芯片的微孔板數(shù)字PCR (micro-chamber digital PCR, mdPCR)和基于微流控技術(shù)的微流控芯片式數(shù)字PCR (microfluidic chip digital PCR, mcdPCR)。另外，基于水凝膠珠、瓊脂糖珠和生物打印技術(shù)等樣本分散方式的dPCR雖然尚未商業(yè)化，但在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究中己取得一定進(jìn)展。微滴式通過油包裹PCR體系形成無數(shù)個油包水微滴，每個微滴是一個獨(dú)立的反應(yīng)單元，這種特殊的微滴在進(jìn)行PCR時能夠保證完整的形態(tài)，不會互相擴(kuò)散，也阻止PCR混合物液滴在熱擴(kuò)增過程的蒸發(fā)；微孔芯片式是利用光刻技術(shù)在硅基上刻蝕出微孔陣列，再通過表面改性、打磨等操作形成數(shù)萬個納升級的表面疏水和孔內(nèi)壁親水的微反應(yīng)室；微流控芯片式則是利用微流控芯片裝置使PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)確快速地分散于芯片孔中，而每個孔都是一個小反應(yīng)體系(納升級)。

雖然基于微流控技術(shù)的微滴生成方法已經(jīng)成熟，但是其技術(shù)本身帶來的高昂成本以及復(fù)雜的轉(zhuǎn)液手工操作使用戶苦不堪言。振動注射技術(shù)的研發(fā)初衷就是要開發(fā)出全自動化，低成本，高可靠性的微滴生成方法。思納福（sniper）振動注射技術(shù)的核心是一個特制的加樣槍頭。槍頭浸入油相中，水相反應(yīng)液勻速排出槍頭，在進(jìn)入油相的過程中，槍頭前端進(jìn)行勻速的擺動，從而產(chǎn)生均一的微液滴。采用振動注射技術(shù)，一方面可以通過控制流速，振動頻率來靈活調(diào)整微滴體積的大小，另一方面該方法可以直接整合到自動化加樣工作站流程中，無需昂貴的微流控耗材，能夠直接在多孔板中生成微滴，在低成本的同時實(shí)現(xiàn)了液滴生成全流程的自動化。同時，振動注射技術(shù)對油相粘度不敏感，無需特殊的溫控環(huán)境就能夠產(chǎn)生均一可控的微滴。

 關(guān)于信號檢測，目前主要有光電倍增管(photomultiplier，PMT)、桂光電子計(jì)數(shù)器(multi-pixelphoton counter, MPPC)、電荷稱合器件(charge-coupled device, CCD)、互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(complementary metal oxide semiconductor, CMOS)、掃描器等5種高分辨率的圖像處理策略。

    dPCR定量計(jì)數(shù)的方法相較于傳統(tǒng)qPCR的定量方法更為簡單，無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算反應(yīng)的擴(kuò)增效率等繁瑣步驟，而是通過直接計(jì)數(shù)的方式得出檢測結(jié)果。根據(jù)陽性信號數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算時，所得的*終結(jié)果不是真實(shí)的目標(biāo)DNA分子拷貝數(shù)存在著一定的可能性，因此需要通過泊松分布概率公式對反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行校正計(jì)算。

數(shù)字PCR在生物學(xué)檢測中的應(yīng)用

dPCR發(fā)展至今己近20年，因其具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)且有效避免PCR抑制劑的影響等優(yōu)勢，在分子檢測和疾病診斷等領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用。尤其是近幾年隨著dPCR儀器的不斷開發(fā)，有大量的研究報道進(jìn)一步證實(shí)了dPCR的優(yōu)勢。

?致病菌的檢測

致病菌，是導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生的主要原因。通過設(shè)計(jì)致病菌的靶基因序列的特異性引物和進(jìn)行擴(kuò)增是應(yīng)用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)檢測的主要原理。dPCR作為第三代PCR技術(shù)，提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，減少了前期的增菌培養(yǎng)過程，大大縮短了檢測分析的時間，而且不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的**定量檢測。

?病毒的檢測

目前病毒檢測常用的方法主要是通過免疫學(xué)方法檢測其蛋白質(zhì)或通過分子生物學(xué)方法檢測其特定核酸。dPCR作為**的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，檢測時無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線且不受基質(zhì)效應(yīng)的影響，適用于病毒分子定量檢測尤其是低拷貝病毒的定量檢測。

?基因突變的檢測

基因突變的檢測方法主要是PCR或Sanger測序法，但這兩種方法對低含量的基因突變檢測靈敏度低，且難以滿足早期突變篩查的需要。dPCR**次被闡述正是用于基因突變的檢測，結(jié)果顯示dPCR對基因突變的分析靈敏度高，且可以對復(fù)雜組織進(jìn)行檢測。

?甲基化DNA的檢測

有研究表明，啟動子高甲基化與一些關(guān)鍵腫瘤抑制基因的沉默有關(guān)，并且這種甲基化通常發(fā)生在癌變的早期階段，所以甲基化DNA檢測被認(rèn)為是癌癥檢測和診斷的重要手段。目前，甲基化DNA的檢測方法己有大量文獻(xiàn)報道，其中基于限制性核酸內(nèi)切酶的一類方法通常與PCR技術(shù)聯(lián)合使用，而dPCR作為**的PCR技術(shù)在甲基化DNA的檢測中也得到了廣泛應(yīng)用。

?細(xì)胞及基因治療方向的應(yīng)用

數(shù)字PCR在細(xì)胞及基因治療方向的應(yīng)用包括病毒載體滴度（例如：被用于定量制品中慢病毒載體滴度、AAV載體滴度、腺病毒載體滴度等），基因轉(zhuǎn)導(dǎo)檢測（例如：用于測量整合到誘導(dǎo)多能干（iPS）細(xì)胞、CD34 +造血干細(xì)胞、T細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒載體的拷貝數(shù)）及基因治療制品中污染物檢測等。

?轉(zhuǎn)基因作物及食品摻假成分的檢測

近年來，轉(zhuǎn)基因食品飽受爭議，準(zhǔn)確靈敏的檢測方法對轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)控尤為重要。GB/T19495系列標(biāo)準(zhǔn)將qPCR作為檢測轉(zhuǎn)基因作物的金標(biāo)準(zhǔn)，但是qPCR在檢測轉(zhuǎn)基因成分基質(zhì)復(fù)雜的作物時會造成偏差，使檢測的結(jié)果不準(zhǔn)確，而且還容易對低濃度的轉(zhuǎn)基因樣品造成漏檢。而dPCR作為第三代PCR技術(shù)，由于其在低豐度檢測和強(qiáng)耐受抑制劑方面的優(yōu)勢，應(yīng)用dPCR對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測也受到了廣泛的關(guān)注。

思納福醫(yī)療科技有限公司（Sniper）成立于2018年4月，以微液滴技術(shù)為根基，專注于下一代精細(xì)化分析醫(yī)療儀器的研發(fā)。團(tuán)隊(duì)來自于北京大學(xué)，北京航空航天大學(xué)等知名高校和企業(yè)，曾從事高端科研設(shè)備的定制化服務(wù)，客戶覆蓋航天、核能、醫(yī)療、新材料等領(lǐng)域，積累了豐富的新技術(shù)工程化和量產(chǎn)化經(jīng)驗(yàn)。團(tuán)隊(duì)開發(fā)了具有全球化自主知識產(chǎn)權(quán)的微滴生成方法——振動注射技術(shù)（Vibrant Injection）

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