聚合酶鏈反應(yīng) （PCR） 是一種實(shí)驗(yàn)室核酸擴(kuò)增技術(shù)，用于使用 DNA 聚合酶 I 酶對脫氧核糖核酸 （DNA） 或核糖核酸 （RNA） 序列的短片段進(jìn)行變性和變性。1985年，Mullis及其同事引入了PCR，并因此獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。它是生物分子科學(xué)中用于不朽的工具，因?yàn)樗哂袡z查和檢測 DNA 擴(kuò)增成分的強(qiáng)大能力。
PART 1
基礎(chǔ)知識（PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR）
PCR：普通的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction , PCR)），以雙鏈DNA為模板，以dNTP為底物，特異性地?cái)U(kuò)增雙鏈DNA。然后采用瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，只能做定性分析。
qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time PCR, or qPCR），以cDNA為模板，以dNTP為底物，對擴(kuò)增出的DNA進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的方法：水解探針法和熒光染料法。
RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR），將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。
RT-qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, or RT-qPCR），是qPCR+RT-PCR的組合，將總RNA或mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再作為模板，以dNTP為底物，進(jìn)行qPCR的定量分析。
PART 2
基礎(chǔ)流程（PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR）
PCR流程：
變性Degeneration ：雙螺旋的氫鍵斷裂而變性解鏈變成單鏈DNA，成為合成DNA的活性模板；
退火Annealing：引物與模板DNA單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，形成局部雙鏈；
延伸Elongation：按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
在經(jīng)歷一次變性→退火→延伸的流程之后，原本只有1條的DNA雙鏈變成了2條；2次之后是4條；以此類推，經(jīng)過變性、退火和延伸重復(fù)若干個(gè)循環(huán)后，就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
qPCR流程及分類：
qPCR在整個(gè)擴(kuò)增的過程中，引入了熒光染料或者熒光基團(tuán)，隨著DNA數(shù)量的成倍增加，反應(yīng)體系中的熒光信號也會增強(qiáng)。借助對熒光信號的強(qiáng)弱進(jìn)行檢測實(shí)時(shí)監(jiān)測每一個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，*后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對待測檢測樣品進(jìn)行定量分析。
目前根據(jù)不同的熒光物質(zhì)，我們可以大致將qPCR分為兩種：熒光染料和探針法；
熒光染料：
主要為SYBRGreenⅠ染料，該染料能與DNA雙鏈結(jié)合，結(jié)合之后會顯示熒光信號，而在沒有結(jié)合的時(shí)候幾乎檢測不到熒光信號，隨著拷貝數(shù)的增加，熒光信號增強(qiáng)。
優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格較低；使用方便；對DNA模板沒有選擇，通用性好；檢測靈敏度高。
缺點(diǎn)：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要通過熔解曲線分析識別擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴(kuò)增；不適合進(jìn)行多重qPCR檢測。
TaqMan探針法：
其原理是根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)一個(gè)能與之特異性結(jié)合的熒光探針，該探針包含兩個(gè)基團(tuán)：一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，正常情況下因?yàn)榇銣缁鶊F(tuán)的存在導(dǎo)致熒光基團(tuán)無法發(fā)出熒光，而在擴(kuò)增時(shí)探針結(jié)合到DNA的模板上，并且擴(kuò)增到探針位置時(shí)兩個(gè)基團(tuán)被切開，從而熒光基團(tuán)可以發(fā)出熒光，同樣隨著拷貝數(shù)的增加，熒光信號增強(qiáng)。
優(yōu)點(diǎn)：檢測特異性強(qiáng)；靈敏度高；適合進(jìn)行多重qPCR檢測；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時(shí)間和原料成本。
缺點(diǎn)：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時(shí)容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹底，成本較高；檢測結(jié)果很難判斷實(shí)際的擴(kuò)增特性。
RT-PCR流程：
反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription - PCR，RT-PCR），是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。RT-PCR 結(jié)合了反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的過程。
該技術(shù)的一般過程為，首先以RNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成其對應(yīng)cDNA，再以cDNA為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。歸根結(jié)底，其就是在PCR過程前加了一個(gè)反轉(zhuǎn)錄過程，之后即可進(jìn)行普通PCR。
RT-qPCR流程及分類：
RT-qPCR是qPCR和RT-PCR的組合，因?yàn)镽T-PCR只可以定性，但不能進(jìn)行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴(kuò)增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進(jìn)行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進(jìn)行。
一步法：
一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。
優(yōu)點(diǎn)：
1. 由于兩步反應(yīng)都在一個(gè)管中完成，因此該方法具有更少的實(shí)驗(yàn)誤差；
2. 更少的移液步驟能夠減少污染的風(fēng)險(xiǎn)；
3. 適用于高通量擴(kuò)增/篩選，快速且可重現(xiàn)性高。
缺點(diǎn)：
1. 無法分別對兩步反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化；
2. 由于反應(yīng)條件是結(jié)合兩步反應(yīng)折中得到的，因此靈敏性不如兩步法；
3. 單一樣品檢測的靶點(diǎn)數(shù)較少。
兩步法：
在兩步法RT-qPCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程是在兩個(gè)管中完成，使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計(jì)策略。
優(yōu)點(diǎn)：
1.能夠建立可以長期保存，并用于多次反應(yīng)的穩(wěn)定的cDNA庫；
2. 靶基因和內(nèi)參基因能夠從同一個(gè)cDNA庫進(jìn)行擴(kuò)增，而不需要多重cDNA庫；
3.能夠優(yōu)化單一反應(yīng)過程的反應(yīng)緩沖液和反應(yīng)條件；
4. 靈活的引發(fā)條件選擇。
缺點(diǎn)：
1. 使用多個(gè)試管，以及更多的移液步驟會增加DNA污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且耗時(shí)；
2. 相較于一步法，需要進(jìn)行更多的優(yōu)化。
PART 3
總結(jié)及產(chǎn)品推薦
總結(jié)：
PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR這四種技術(shù)的主要區(qū)別在于它們的應(yīng)用領(lǐng)域和檢測目標(biāo)不同。PCR主要用于DNA序列的擴(kuò)增和檢測；qPCR可以實(shí)時(shí)定量檢測DNA或cDNA的含量；RT-PCR主要用于RNA分子的擴(kuò)增和檢測；而RT-qPCR則結(jié)合了RT-PCR和qPCR的技術(shù)，可以對RNA分子進(jìn)行定量分析。
產(chǎn)品推薦：
PCR試劑：
qPCR/RT-qPCR試劑：
PCR相關(guān)耗材：
PART 4
參考文獻(xiàn)
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